Os oligonucleotídeos são componentes essenciais em diversas aplicações de biotecnologia e biologia molecular. Os oligos são entregues secos por ser a forma mais estável, e a maneira como são ressuspendidos pode impactar significativamente a qualidade e a eficácia dos seus experimentos. Embora seja comum ressuspender oligos em água, o uso de soluções tampão, como o TE (Tris-EDTA), é altamente recomendado.
Neste artigo, discutiremos os motivos para evitar a ressuspensão em água, como preparar a solução tampão adequada e as melhores práticas de armazenamento.
Motivos para Não Ressuspender Seus Oligos em Água
1- Risco de Contaminação
A água é uma substância amplamente utilizada em laboratórios, sendo empregada em praticamente todas as atividades e por todos os usuários. Isso aumenta significativamente a possibilidade de contaminação acidental. Se a água utilizada para ressuspender os oligos estiver contaminada, todo o lote de oligos pode ser comprometido, resultando em desperdício de materiais e recursos. Para evitar esse risco, é melhor não utilizar água para diluir os oligos.
2- Degradação:
Os oligos mantêm sua estabilidade e integridade por muito mais tempo quando são dissolvidos em uma solução tampão.
O tampão oferece uma proteção eficaz contra a degradação, preservando a funcionalidade dos oligos por anos. Em contraste, a água pode permitir que os oligos sejam degradados por enzimas, como as DNAses.
As DNAses são enzimas que clivam o DNA, e a água pode conter traços dessas enzimas, mesmo em pequenas quantidades. Essas enzimas podem ser ativas na água, degradando os oligos e comprometendo sua eficácia e vida útil. Além disso, a água pode não proporcionar o ambiente de pH ideal para a estabilidade dos oligos, ao contrário do tampão, que é formulado especificamente para manter a estabilidade e funcionalidade dos oligos ao longo do tempo.
Como Preparar a Solução Tampão
Para garantir a máxima estabilidade e integridade dos oligos, é recomendável ressuspender os oligos em tampão, esse tampão é o TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). Note que o EDTA é 0,1mM, e não 1mM. O TE ajuda a manter o pH da solução constante e a prevenir a degradação do oligo, porém, o TE inibe a PCR devido à ação quelante do EDTA. Assim, essa fórmula irá proteger seus oligos sem inibir sua PCR.
Aqui está um passo a passo para preparar essa solução tampão:
1- Preparação da Solução de Tris 1M (pH 8,0)
Ingredientes:
- Tris base: 121,12g
- HCl (para ajustar o pH)
- Água Milli-Q
Procedimento:
1- Pese 121,12g de Tris base e dissolva em aproximadamente 800ml de água Milli-Q.
2- Ajuste o pH da solução para 8,0 adicionando HCl concentrado lentamente enquanto mistura.
3- Complete o volume da solução para 1 litro com água Milli-Q.
4- Autoclave a solução antes de usá-la.
2- Preparação da Solução de EDTA 0,5M (pH 8,0)
Ingredientes:
- EDTA: 9,305g (PM = 372,22)
- NaOH (para ajustar o pH)
- Água Milli-Q
Procedimento:
1- Pese 9,305g de EDTA e dissolva em aproximadamente 40ml de água Milli-Q.
2- Ajuste o pH da solução para 8,0 adicionando NaOH concentrado lentamente enquanto mistura.
3- Complete o volume da solução para 50ml com água Milli-Q.
4- Autoclave a solução antes de usá-la.
3- Preparação da Solução Tampão TE 1X (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5 - 8,0)
Ingredientes:
- Solução de Tris 1M
- Solução de EDTA 0,5M
- Água Milli-Q
Procedimento:
1- Em um frasco estéril, adicione:
- 5ml da solução de Tris 1M
- 0,1ml da solução de EDTA 0,5M
- 494,9ml de água Milli-Q
2- Misture bem para garantir que as soluções estejam completamente homogêneas.
3- Armazene a solução TE 1X em temperatura ambiente, em um frasco fechado com tampa e parafilme para evitar contaminação.
Como Armazenar Oligos Após Ressuspensão
Uma vez que os oligos tenham sido ressuspensos no TE (Tris-EDTA), é importante seguir as melhores práticas de armazenamento para garantir sua estabilidade e funcionalidade ao longo do tempo.
Os oligos ressuspendidos em tampão são estáveis por muito tempo se conservados a uma temperatura de -20°C. Mas é importante evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Anote a data de descongelamento e utilize o oligo descongelado dentro de um prazo razoável para garantir a máxima eficácia.
Embora a ressuspensão de oligos em água possa parecer conveniente, o uso de TE (Tris-EDTA) oferece uma série de vantagens cruciais para a estabilidade e integridade dos oligos. A estabilidade do pH, a proteção contra degradação enzimática e a preservação a longo prazo são fundamentais para garantir a eficácia dos seus experimentos. Ao seguir as melhores práticas de preparação e armazenamento descritas, você pode maximizar o desempenho dos seus oligos e obter resultados mais confiáveis em suas pesquisas.
Referências:
Vários autores. Consejos para elegir correctamente la purificación de sondas y oligos. Disponível em: https://www.ibiantech.com/consejos-elegir-correctamente-la-purificacion-sondas-oligos/
Vários autores. DNA Oligonucleotide Resuspension and Storage. Disponível em: http://gambusia.zo.ncsu.edu/protocols/DNA%20Oligonucleotide%20Resuspension%20and%20Storage.pdf
