As sondas de hidrólise são amplamente utilizadas em técnicas de PCR em tempo real (qPCR), que são essenciais para a detecção e quantificação de sequências-alvo específicas no DNA.
No artigo de hoje, vamos explorar como as sondas de hidrólise funcionam, como escolher a mais adequada para o seu experimento e suas principais aplicações na pesquisa e no diagnóstico molecular.
O que são Sondas de Hidrólise?
As sondas de hidrólise são fragmentos de DNA de fita simples (oligonucleotídeos) projetados para detectar uma sequência-alvo específica durante a amplificação por PCR em tempo real (qPCR). Diferente dos primers, que servem como iniciadores para a síntese do DNA, as sondas de hidrólise desempenham um papel crucial na monitoração da amplificação em tempo real.
Essas sondas contêm dois componentes essenciais que as diferenciam dos oligonucleotídeos convencionais: um fluoróforo na extremidade 5’, que emite luz fluorescente, e um quencher na extremidade 3’, que inibe a fluorescência quando ambos estão próximos um do outro. Essa configuração permite que o sinal fluorescente só seja gerado quando a sonda é decomposta durante o processo de amplificação, proporcionando uma leitura precisa do produto amplificado.
Como funciona a Sonda de Hidrólise?
Durante a amplificação do DNA, a sonda de hidrólise se liga a uma região complementar da sequência-alvo, que está situada entre os primers forward e reverse. À medida que a enzima DNA polimerase sintetiza o novo DNA, ela degrada a sonda ligada à sequência-alvo. Esse processo de degradação separa o fluoróforo do quencher, resultando na liberação de fluorescência. A luz emitida pelo fluoróforo pode ser detectada pelo termociclador, permitindo que o sinal de fluorescência seja monitorado em tempo real.
A intensidade da fluorescência aumenta proporcionalmente à quantidade de produto amplificado, tornando possível quantificar o DNA com alta precisão à medida que a reação avança. Essa monitorização em tempo real é um dos maiores avanços do PCR em tempo real, pois oferece uma forma direta de medir a quantidade de DNA presente na amostra.
Como escolher uma Sonda de Hidrólise?
A escolha da sonda de hidrólise correta é crucial para garantir resultados precisos e eficientes no seu ensaio. Um dos principais fatores a ser considerado é o fluoróforo.
O fluoróforo deve ser compatível com o termociclador utilizado, já que cada equipamento pode detectar diferentes comprimentos de onda de fluorescência. Entre os fluoróforos mais comuns estão o FAM, HEX, ROX e VIC, e a escolha deve ser feita de acordo com as capacidades do equipamento que estará realizando a leitura.
Além do fluoróforo, o quencher também deve ser escolhido com cuidado. O quencher é responsável por bloquear a fluorescência até que a sonda seja decomposta. Os quenchers mais comuns são o BHQ-1 e o BHQ-2, que são compatíveis com vários fluoróforos e ajudam a minimizar o ruído de fundo, melhorando a precisão na detecção do produto amplificado.
Aplicações das Sondas de Hidrólise
As sondas de hidrólise são amplamente usadas em testes de diagnóstico molecular, como aqueles que detectam doenças infecciosas, distúrbios genéticos e biomarcadores específicos. Sua alta especificidade e sensibilidade tornam elas ideais para a quantificação precisa de DNA, especialmente em ensaios de qPCR, onde a detecção em tempo real e a quantificação relativa do material genético são essenciais.
Além disso, as sondas de hidrólise são essenciais em ambientes de pesquisa científica, onde a detecção e quantificação de pequenas quantidades de DNA podem ser determinantes para o sucesso da pesquisa. A capacidade de monitorar a amplificação durante o processo permite que os pesquisadores acompanhem a progressão da reação de forma mais eficiente, evitando a necessidade de análises pós-PCR complexas.
Diferença entre Sondas de Hidrólise e Sondas Taqman
Se você já ouviu falar das sondas TaqMan®, saiba que elas são um tipo específico de sonda de hidrólise. Na verdade, "TaqMan®" é um nome comercial registrado pela empresa Thermo Fisher Scientific, usado para descrever essa tecnologia baseada na manipulação da sonda durante a amplificação do DNA.
O princípio de funcionamento das sondas TaqMan® é exatamente o mesmo das sondas de hidrólise que explicamos anteriormente: elas contêm um fluoróforo e um supressor, e a fluorescência só é emitida quando uma sonda é clivada pela Taq DNA polimerase durante uma ocorrência de PCR em tempo real.
Por ser amplamente utilizado em pesquisas e diagnósticos moleculares, o nome "TaqMan®" acabou se tornando correspondente a esse tipo de sonda, mesmo existindo outras sondas de hidrólise de outras marcas, como a Exxtend, disponíveis no mercado.
As sondas de hidrólise são ferramentas poderosas para melhorar a precisão e a eficácia dos ensaios de qPCR. Elas permitem monitorar a amplificação do DNA em tempo real, oferecendo uma maneira direta e eficiente de quantificar o DNA amplificado. A escolha do fluoróforo e do quencher corretos, juntamente com o entendimento da função de cada componente, é essencial para garantir resultados confiáveis e de alta qualidade.
Essas sondas têm se tornado uma ferramenta indispensável em diversas áreas da biotecnologia e do diagnóstico molecular, desde pesquisas acadêmicas até testes clínicos de alto impacto.
