A purificação de oligonucleotídeos é um passo crucial na preparação de oligos para aplicações em biologia molecular. A pureza do oligo pode impactar significativamente os resultados de experimentos, especialmente aqueles que exigem alta precisão e sensibilidade.
Neste artigo, discutiremos o que é a purificação de oligonucleotídeos, por que ela é necessária e exploraremos os principais métodos utilizados: dessalinização, purificação por fase reversa (RP-OPC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
O que é a purificação de um oligonucleotídeo?
A purificação de oligonucleotídeos é o processo de remover impurezas e subprodutos gerados durante a síntese do oligo. Essas impurezas podem incluir sais, fragmentos truncados (oligos incompletos), e outras moléculas indesejadas. O objetivo é obter um oligo de alta pureza, contendo a maior proporção possível da sequência desejada.
Por que preciso purificar o meu oligo?
Purificar oligonucleotídeos é essencial para garantir a precisão e confiabilidade dos resultados experimentais. Impurezas, como oligos truncados e sais, podem interferir nas reações e análises subsequentes.
Por exemplo, em experimentos de PCR, oligos incompletos podem competir com os oligos completos, levando a amplificações inespecíficas. Para aplicações sensíveis, como qPCR, sequenciamento e ensaios CRISPR, a pureza do oligo é ainda mais crítica.
Por isso, não é possível adquirir um oligonucleotídeo sem escolher um método de purificação disponibilizado pela empresa.
Métodos de Purificação
Existem diversos métodos para purificar oligonucleotídeos, cada um com suas vantagens e limitações, dependendo das necessidades específicas do experimento. A escolha do método adequado é fundamental para garantir que o oligo sintetizado atenda aos critérios de pureza necessários para aplicação que será destinado. Alguns dos métodos mais comuns de purificação são: dessalinização, purificação por fase reversa (RP-OPC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
Dessalinização
A dessalinização utiliza uma coluna com gel poroso para separar as partículas com base no tamanho molecular.
Esse método remove sais e pequenos fragmentos de oligos incompletos, mas não elimina sequências truncadas de tamanho semelhante aos oligos completos.
É adequado para oligos entre 20 a 30 bases utilizados em PCR convencional, onde as sequências incompletas não afetam significativamente os resultados. No entanto, não é indicado para experimentos sensíveis que requerem oligos de alta pureza, pois não removem oligos truncados que tenham o tamanho similar ao do oligo completo.
Lembrando que cada tipo de purificação tem um rendimento mínimo garantido em nmol, assim é possível quantificar qual escala de síntese é a melhor para o oligo ser sintetizado e atender às necessidades da pesquisa. Confira a seguir uma tabela com o rendimento mínimo da purificação por dessalinização:
RP-OPC
A purificação por fase reversa (RP-OPC) utiliza uma coluna preenchida com resina polimérica que se liga fortemente ao grupo DMT presente na extremidade 5' dos oligos completos. Este método remove sais, impurezas comuns e sequências truncadas sem o grupo DMT.
É indicado para oligos de todos os tamanhos, especialmente os usados em experimentos que exigem alto grau de pureza, como qPCR, sequenciamento, microarray, blotting e clonagem. No entanto, não pode ser aplicada a oligos com fluoróforos ou modificações na extremidade 5', por não possuírem o grupo DMT.
HPLC
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utiliza a afinidade diferencial entre oligos completos e a coluna para separar impurezas. Um gradiente de concentração do conteúdo hídrico do reagente remove progressivamente as impurezas com base em suas propriedades hidrofóbicas.
Esse método é controlado por espectroscopia, permitindo a recuperação de oligos com alta pureza, livres de restos de fluoróforos.
HPLC é ideal para sondas, oligos marcados, oligos longos e aplicações que exigem alta pureza, como qPCR, CRISPR, microarray, blotting e clonagem. Apesar de resultar em perdas maiores no rendimento final, oferece a maior pureza possível (≥ 85%).
Escolher o método de purificação adequado para seus oligonucleotídeos depende das necessidades específicas do seu experimento. Dessalinização é uma opção rápida e adequada para PCR convencional, RP-OPC oferece uma boa pureza para uma ampla gama de aplicações, e HPLC é a escolha para os experimentos mais exigentes que requerem oligos de altíssima pureza. Entender as vantagens e limitações de cada método permitirá otimizar seus resultados experimentais.
