A reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) é uma técnica amplamente utilizada para a quantificação de DNA, oferecendo informações valiosas para pesquisas em genética, microbiologia e muitas outras áreas. Existem diferentes abordagens para a detecção de produtos de PCR, sendo duas das mais comuns o uso de sondas de hidrólise e o SYBR Green.
O que são Sondas de Hidrólise?
As sondas de hidrólise são pequenos fragmentos de DNA fita simples (oligonucleotídeos) desenhados para detectar uma sequência-alvo específica durante a PCR em tempo real (qPCR).
Elas contêm dois elementos que as diferenciam dos oligos comuns: um fluoróforo na extremidade 5’, que emite luz fluorescente, e um quencher na extremidade 3’, que inibe essa fluorescência quando ambos estão próximos.
Como funciona a Sonda de Hidrólise
Durante a amplificação do DNA, a sonda se liga a uma região complementar da sequência-alvo, localizada entre os primers forward e reverse.
Quando a enzima DNA polimerase começa a sintetizar o novo DNA, ela degrada a sonda que está ligada à sequência-alvo. Esse processo separa o fluoróforo do quencher, liberando a fluorescência, que agora pode ser detectada.
A intensidade da fluorescência aumenta proporcionalmente à quantidade de produto amplificado, e o termociclador monitora esse sinal em tempo real, permitindo a quantificação precisa do DNA.
Como escolher uma Sonda de Hidrólise
Na escolha da sonda de hidrólise, é importante selecionar o fluoróforo adequado ao seu termociclador. Ele detecta os comprimentos de onda que cada fluoróforo emite e cada equipamento pode detectar diferentes cores (você pode conferir essa informação no manual do equipamento). As fluorescências mais comuns incluem FAM, HEX, ROX e VIC.
O quencher também deve ser escolhido com cuidado para garantir que ele seja capaz de neutralizar corretamente a fluorescência até que a sonda seja degradada pela enzima. Os mais comuns são o BHQ-1 e BHQ-2, que são compatíveis com diferentes fluoróforos e ajudam a minimizar o ruído de fundo, resultando em maior precisão na detecção do DNA amplificado.
O que é SYBR Green?
SYBR Green é um corante fluorescente amplamente utilizado na reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para detecção de DNA de fita dupla. Ele é uma molécula intercalante, o que significa que se insere entre as bases do DNA de fita dupla, emitindo fluorescência apenas quando está ligado a esse tipo de DNA. Quando o DNA de fita dupla se forma durante a amplificação da PCR, o SYBR Green se liga a ele, e a intensidade da fluorescência aumenta proporcionalmente à quantidade de DNA presente na reação.
Esse corante é uma escolha simples e econômica, pois, ao contrário das sondas de hidrólise, o SYBR Green não é específico para uma determinada sequência de DNA.
No entanto, por se ligar a qualquer DNA de fita dupla, o SYBR Green também pode detectar produtos indesejados, como dímeros de primers ou amplificações inespecíficas. Por isso, é importante realizar uma análise posterior, como a curva de dissociação, para garantir a especificidade do produto amplificado.
Como funciona o SYBR Green?
Durante o ciclo de PCR, à medida que a reação progride e mais DNA de fita dupla é produzido, o SYBR Green se liga ao DNA gerado entre os primers forward e reverse. Ou seja, a fluorescência emitida é proporcional a quantidade de DNA que está sendo formado. O termociclador, equipado com um detector de fluorescência, monitora esse aumento em tempo real, permitindo a quantificação precisa do DNA amplificado.
No entanto, como o SYBR Green se liga a qualquer DNA de fita dupla, incluindo produtos não específicos ou dímeros de primers, é necessário um passo adicional para verificar a especificidade da amplificação: a curva de dissociação.
Após a conclusão da PCR, a curva de dissociação (ou curva de melting) é realizada para garantir que o sinal de fluorescência corresponde ao produto correto. Nesse procedimento, a temperatura da reação é gradualmente aumentada, e o DNA de fita dupla se desnatura (ou se separa em fitas simples), resultando em uma queda da fluorescência. O termociclador registra essa mudança e gera um gráfico que mostra a temperatura em que o DNA se dissocia. Produtos específicos de PCR têm um perfil de dissociação característico, enquanto produtos não específicos ou dímeros de primers geralmente apresentam perfis diferentes.
Assim, a curva de dissociação serve como um importante controle de qualidade, permitindo confirmar se o DNA amplificado é o produto desejado ou se houve amplificações inespecíficas durante o processo.
Comparação entre Sondas de Hidrólise e SYBR Green
Precisão e Especificidade
As sondas de hidrólise oferecem maior precisão e especificidade em comparação com o SYBR Green, pois detectam apenas a sequência-alvo entre os primers, minimizando o risco de amplificações não específicas.
Já o SYBR Green pode se ligar a qualquer DNA de fita dupla, o que pode resultar na detecção de produtos indesejados, exigindo uma análise adicional para garantir a especificidade.
Custo e Complexidade
O SYBR Green é mais acessível e fácil de implementar, pois não requer o design de sondas específicas.
As sondas de hidrólise, por outro lado, são mais caras e complexas, já que precisam ser projetadas para cada alvo específico.
Aplicações
Sondas de hidrólise são ideais para ensaios que requerem alta precisão, como a detecção de variantes genéticas ou a análise de múltiplas sequências-alvo (multiplex).
SYBR Green é adequado para análises gerais e situações em que o custo é uma preocupação importante, mas requer medidas adicionais para garantir a especificidade dos produtos amplificados.
Ambas as metodologias, sondas de hidrólise e SYBR Green, têm suas próprias vantagens e limitações. A escolha entre elas deve ser baseada nas necessidades específicas do experimento, incluindo requisitos de precisão, custo e complexidade.
Compreender essas diferenças, bem como o papel dos primers forward e reverse na amplificação e detecção, pode ajudar os pesquisadores a selecionar a abordagem mais adequada para suas aplicações de qPCR.
Primers e Sondas na Exxtend
Na Exxtend, oferecemos primers e sondas de alta qualidade, projetados para atender às necessidades específicas de cada projeto.
Nossos primers garantem alta especificidade e eficiência para diversas aplicações de PCR, enquanto nossas sondas de hidrólise proporcionam precisão na detecção de sequências-alvo durante a PCR em tempo real.
Para solicitar primers e sondas, basta enviar a sequência desejada, junto com a escala e o tipo de purificação.
Referências
Vários autores. PCR quantitativo em tempo real (real-time PCR). Disponível em: https://www.fleury.com.br/medico/manuais-diagnosticos/hematologia-manual/pcr
SERRANO, Elisabet. PCR em Tempo Real. Disponível em: https://legado.moodle.ufsc.br/pluginfile.php/1391392/mod_resource/content/0/Real%20Time%20PCR_auladef2.pdf
Vários autores. PCR em Tempo Real (qPCR): Aplicação no diagnóstico de Doenças. Disponível em: https://kasvi.com.br/pcr-em-tempo-real-qpcr-diagnostico-doencas/#:~:text=A%20sigla%20qPCR%20significa%20PCR%20quantitativa%20em,durante%20o%20processo%20de%20amplifica%C3%A7%C3%A3o%20do%20DNA.
GRIMBERG, Brian. SYBR Verde I. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/sybr-green-i
