A escolha do método de purificação é um fator essencial para garantir a qualidade dos oligonucleotídeos no seu experimento.
Trabalhamos com três tipos de métodos aqui na Exxtend: dessalinização, RP-OPC (Reversed Phase - Oligonucleotide Purification Cartridge ou, em português, Purificação de oligos por cartucho de fase reversa) e HPLC (High Performance Liquid Chromatography ou, em português, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência), sendo a dessalinização a mais solicitada.
Porém, não recomendamos a dessalinização para oligos com mais de 30 bases, e você pode entender melhor o porquê neste artigo.
Como os oligonucleotídeos são sintetizados?
Os oligos são produzidos por um processo chamado adição de fosforamiditas em fase sólida, uma metodologia química cíclica. O número de ciclos de síntese corresponde ao número de bases do oligo. Por exemplo, para um primer de 20 bases, a fase sólida passará por 20 ciclos contendo as seguintes reações:
- Detritilação
- Acoplamento da base
- Bloqueio
- Oxidação
Embora o processo seja altamente eficiente (98,5 a 99,5% de acoplamento correto por ciclo), ele nunca atinge 100% de sucesso, como qualquer reação química. Isso significa que, a cada ciclo, uma pequena fração das moléculas não recebe a base corretamente e, por segurança, é bloqueada para não seguir nos ciclos seguintes. Essas moléculas formam os chamados oligos truncados.
O impacto dos oligos truncados
Os oligos truncados são inevitáveis na síntese, e sua quantidade aumenta conforme o número de ciclos. Isso significa que quanto maior o oligo, maior será a presença de sequências incompletas na amostra final. Em oligos acima de 30 bases, essa quantidade pode ser significativa e influenciar diretamente a performance dos experimentos.
Dependendo da aplicação, os oligos truncados podem interferir nos resultados. Se a sua técnica exige alta especificidade e eficiência, como em qPCR, clonagem, sequenciamento ou CRISPR, a presença dessas sequências incompletas pode comprometer os dados.
A dessalinização não remove todos os oligos truncados
A dessalinização é um método simples de purificação, que utiliza uma coluna com gel poroso para remover sais e pequenas impurezas da síntese com base no tamanho molecular. No entanto, ela não separa oligos truncados que tenham um tamanho próximo ao do oligo completo.
Isso ocorre porque a dessalinização não tem precisão suficiente para distinguir um oligo completo de um truncado maior. Como a separação ocorre com base no tamanho, oligos truncados de tamanhos próximos ao desejado podem permanecer na amostra final.
Enquanto a dessalinização pode remover impurezas menores, como oligos truncados de até 10 bases, ela não é eficaz para remover sequências incompletas maiores.
Isso significa que, ao optar por esse método com oligos acima de 30 bases, você pode estar recebendo uma amostra com uma quantidade considerável de oligos incompletos, que podem impactar seu experimento.
Qual a alternativa ideal?
Para oligos acima de 30 bases ou para aplicações que exigem alta pureza, recomendamos que solicite os seus oligos com purificação por RP-OPC ou por HPLC. Essas técnicas garantem a remoção tanto de sais quanto de oligos incompletos, proporcionando maior confiabilidade nos resultados.
Se você tem dúvidas sobre a melhor opção de purificação para o seu experimento, entre em contato com nossa equipe! Estamos sempre prontos para ajudar a garantir que você tenha os melhores oligos para sua pesquisa.
